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技術常見問題
1. 無Ct值出現
Ø 檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
Ø 引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。
Ø 模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
Ø 模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
2. Ct值出現過晚(Ct>38)
Ø 擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針;改用三步法進行反應;適當降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。
Ø PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
Ø PCR產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。
3. 標準曲線線性關系不佳
Ø 加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。
Ø 標準品出現降解: 應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。
Ø 引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針
模板中存在抑制物，或模板濃度過高
4. 負對照有信號
Ø 引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
Ø 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
Ø 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
Ø 模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
5. 溶解曲線不止一個主峰
Ø 引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
Ø 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
Ø 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
Ø 模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
6. 擴增效率低
Ø 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
Ø 反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
Ø 反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷?
判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性
如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數據用于分析。
8. 擴增曲線的異常?比如“S”型曲線?
Ø 參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)
Ø 模板的濃度太高或者降解
Ø 熒光染料的降解
參考資料
1. 百泰克、Qiagen、ABI熒光定量PCR技術講座和生物通、丁香園、螺旋網相關資料。
2. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method Thomas D Schmittgen and Kenneth J Livak 2008, Nature Protocols: Vol3:1101-1108
3. Real-time PCR for mRNA Quantitation Marisa L. Wong and Juan F. Medrano 2005, BioTechniques, Vol39:1-11
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